来源：园艺与林学学院
近日，我校园艺与林学学院胡楠副教授团队在《Plant Hormones》发表题为“Strategies and tools for optimizing plant genome editing systems”的研究论文。园艺与林学学院戴冬洋博士为第一作者，园艺与林学学院胡楠副教授为通讯作者，西南大学李金华教授参与该项研究。该研究分别得到国家自然科学基金、中国博士后科学基金和塔里木大学校长基金支持。
本研究针对植物CRISPR/Cas9基因组编辑系统外源基因递送与表达效率低下的核心瓶颈，开展载体工具开发与技术优化。针对农杆菌转化中T-DNA左边界易被宿主降解、引发外源基因表达异常的问题，团队首创左边界完整性可视化监测工具，构建pHNCas9-EGFP报告载体，将EGFP元件精准置于左边界末端，通过荧光表型快速判别边界完整性。番茄转基因验证显示，该工具荧光消失表型与左边界大片段缺失对应效率达85.71%，突破传统检测局限，为遗传转化体系优化提供高效直观手段，也为基因组编辑载体优化奠定技术基础。
图1 pHNCas9-EGFP载体示意图及其在检测番茄T-DNA左边界缺失中的应用
本研究搭建高效稳定的启动子筛选平台，设计含GUS与EGFP双报告基因的pHN2G载体，优化混合取样方法以提升数据稳定性；借助该系统定量比对多种启动子活性，探明新型嵌合启动子P35SIC47驱动活性为传统P35SI的27倍，为高效表达元件筛选提供便捷工具。同时构建Cas9蛋白翻译效率评估系统，搭建pHN2AGUS与pHN2AGFP融合报告载体，实现蛋白翻译水平精准量化，证实人类密码子优化的hCas9在植物细胞中翻译效率更优。此外，研究提出多基因编辑系统结构优化新策略，通过pHN2G6载体明确poly (A) 长度优化可显著提升基因表达活性，为STU系统结构优化提供直接依据。
图2 pHN2G6载体用于评估poly (A) 长度对基因表达的影响及新型高效编辑载体的构建
基于上述优化成果整合构建的pHNRhCas9NG载体，在番茄中实现了100%突变率和92.5%可视化筛选效率，有力验证了整套优化工具和策略的有效性。（文/图：戴冬洋）
